活体生物发光成像追踪大鼠跟腱内移植干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：移植脂肪源干细胞在活体内的归巢、迁移、增殖和分化的机制仍未得到充分阐明。活体生物发光活体成像技术是近来发展起来的一种可以直接检测活细胞在动物体内生物学行为的新的技术方法。
目的：探讨用活体生物发光成像技术检测大鼠跟腱内移植的经荧光基因修饰的脂肪源干细胞可行性。
方法：分离培养大鼠腹腔来源的脂肪源干细胞，用浓度为3×10¹⁰ L^-1携带虫荧光素酶的腺病毒载体对其进行转染，观察转染对脂肪源干细胞的影响；将转染的脂肪源干细胞移植到大鼠跟腱缺损处，移植后1，4，7，14 d用活体生物发光成像技术检测移植脂肪源干细胞荧光素酶的表达，移植后28 d跟腱标本冰冻切片在荧光显微镜下观察。
结果与结论：在体外，腺病毒转染对脂肪源干细胞的生长和增殖无明显影响(P > 0.05)。细胞移植后1，4，7，14 d，活体生物发光成像技术在实验侧修复段跟腱检测到的荧光表达强度分别为(1.22±0.43)×10⁶、(1.81±0.76)×10⁶、(1.88±0.69)×10⁶和(0.89±0.26)×10⁵光子/s(n=6)。而对照侧跟腱修复段未检测到荧光表达；移植后28 d，实验侧跟腱冰冻切片在荧光显微镜下见到大量表达荧光的细胞。表明活体生物发光成像技术可成功追踪大鼠跟腱内移植的经荧光基因修饰的脂肪源干细胞。脂肪源干细胞有望成为肌腱组织工程的种子细胞。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 缺陷型腺病毒, 脂肪源干细胞, 腺病毒, 细胞转染, 荧光素酶, 肌腱, 生物发光成像, 荧光表达, 组织工程, 种子细胞, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The mechanisms for the homing, migration, proliferation and differentiation of transplanted adipose tissue derived stem cells remain unclear. The in vivo bioluminescent imaging system is a newly developed technique for directly detecting the biological behaviors of transplanted cells in vivo.
OBJECTIVE: To demonstrate the feasibility of using in vivo bioluminescent imaging system to monitor the genetically modified adipose tissue derived stem cells transplanted in Achilles tendon of rats.
METHODS: Adipose tissue derived stem cells isolated from the abdominal cavity of Sprague-Dawley rat were transduced with an adenovirus containing the luciferase reporter gene (3×10¹⁰/L), to observe the influence of transfection on the adipose tissue derived stem cells. Subsequently, the transfected cells were implanted into Achilles tendon defects in rats. The in vivo bioluminescent imaging system was used at days 1, 4, 7 and 14 following transplantation to assess the luciferase expression. The cryosections of repaired Achilles tendon of rats were observed under fluorescence microscope at day 28 postoperatively.
RESULTS AND CONCLUSION: No influence on the morphology and proliferation of adipose tissue derived stem cells was observed after transducing in vitro (P > 0.05). On the repaired Achilles tendon, the luciferase gene expression detected with in vivo bioluminescent imaging system at days 1, 4, 7 and 14 was respectively (1.22±0.43)×10⁶, (1.81±0.76)×10⁶, (1.88±0.69)×10⁶ and (0.89±0.26)×10⁵ counts/s (n=6). Abundant adipose tissue derived stem cells with luciferase expression were also seen in tendon cryosections of this side under fluorescence microscope at day 28. The luciferase gene expression was not detected in the control side. Experimental findings demonstrate that the in vivo bioluminescent imaging system can successfully monitor the fluorogene modified adipose tissue derived stem cells that are implanted into the rat Achilles tendon, and adipose tissue derived stem cells are a potential seed cells in tendon tissue engineering.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, deficient adenovirus, adipose tissue derived stem cells, adenovirus, cell transfection, luciferase, tendon, bioluminesent imaging, fluorescence expression, tissue engineering, seed cells, provincial grants-supported paper, stem cells photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

黄德清，Gary Balian. 活体生物发光成像追踪大鼠跟腱内移植干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(23): 4240-4247.

Huang De-qing, Gary Balian. Monitoring transplanted stem cells in rat Achilles tendon by in vivobioluminescent imaging[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(23): 4240-4247.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 体外实验纳入8只大鼠在脱颈处死前均无死亡，设自身对照，双侧后肢手术及分组情况如前述，术后动物无死亡，伤口无感染，早期有跟腱无力步态，1周后步态逐渐恢复正常。
2.2 脂肪源性干细胞的分离、培养和鉴定 倒置显微镜下观察，原代细胞接种4-6 h后开始贴壁，初为小的圆形细胞，24 h后细胞逐渐伸展成纺锤形，细胞密度大约为50%，72 h后细胞数量明显增加，密度为80%，细胞呈短梭形或多角形，随着培养时间的延长，梭形细胞逐渐占据优势。经1∶2传代后的细胞生长速度明显快，72 h后细胞即已长满培养瓶底，融合成片状，细胞排列更加整齐有序，杂质细胞基本消失，多次传代后细胞分布更加均匀有序，经鉴定为脂肪源性间充质干细胞^[12] 。
2.3 缺陷型腺病毒载体转染后脂肪源干细胞的形态变化及增殖情况 转染与未转染组细胞数量见表1。缺陷型腺病毒载体转染脂肪源干细胞后可见细胞贴壁生长，形态正常，细胞核清晰，并且成倍增殖，未见到胞浆毒性作用。在12 d时细胞数量明显比6 d时增多(P < 0.05)，并且转染和未转染两者的细胞数量分别在6 d和12 d时相比较差异无显著性意义(P > 0.05)。说明缺陷型腺病毒载体的转染对脂肪源干细胞的生长状态和增殖没有明显影响。

2.4 活体生物发光成像结果 用活体成像软件分析追踪植入跟腱脂肪源干细胞荧光素酶的表达。结果显示建模后24 h右侧(实验侧)细胞植入的部位检测到荧光素酶的表达，生物发光信号最大强度平均为(1.22±0.43)×10⁶光子/s。第4天的荧光表达增强，为(1.81±0.76)×10⁶光子/s，7 d时荧光表达达到峰值，为(1.88±0.69)×10⁶ 光子/s，14 d仍可检测的荧光表达，但明显减弱，为(0.89±0.26)×10⁵光子/s。荧光表达的衰减可能表明细胞死亡、迁徙、基因丢失或与再生组织以及鼠毛的厚度增加有关。在跟腱以外的区域未发现荧光表达。而左侧(对照侧)跟腱修复区域始终未检测到绿色荧光的表达，见图1。

2.5 跟腱切片荧光显微镜观察 大鼠跟腱修复段标本冰冻切片在荧光显微镜下观察，缺陷型腺病毒载体标记的脂肪源干细胞移植侧可以找到大量发出绿色荧光的标记细胞，荧光强度较强，但细胞形态不能十分清楚辨别，难以精确计数，标记细胞集中分布在修复段，修复段以外区域未找到标记细胞，见图2；而对照侧，冰冻切片中未能找到绿色荧光细胞，见图3。 2.6 不良反应 大鼠跟腱修复区域未见明显炎症反应和异物反应，此次实验未作组织切片的苏木精伊红染色，还有待于将进一步研究。

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引言

肌腱缺损往往需要用肌腱移植修复，然而，自体肌腱移植来源有限、供区并发症多；异体移植则可能引起排异反应及传染性疾病的传播等；人工肌腱移植可引起炎症反应、固定失败等，目前已很少使用^[1-3] 。肌腱组织工程技术为肌腱缺损的修复开辟了新的途径，其相关研究已取得显著的进展，但其修复肌腱缺损的临床效果仍难尽如人意，仍不能满足临床需要。因此，现有肌腱组织工程技术仍需某些改进^[4] 。
目前这一领域的研究热点之一是寻找和使用功能活跃的种子细胞。有研究表明骨髓源间充质干细胞具备分化成腱细胞的能力，已成为肌腱组织工程研究常用的种子细胞，但骨髓的获取往往有并发症，所得干细胞数量有限^[5]。2001年Zuk等^[6]首次从人抽脂术中获取的脂肪组织悬液中分离获得了具有多向分化能力的脂肪源间充质干细胞。由于脂肪组织容易大量获得，所得细胞数量多，脂肪组织抽取后残留于供区的脂肪组织仍可扩增，对供区的损伤小，这就使脂肪源间充质干细胞一经问世便引起了人们的广泛关注，自然也成为了肌腱组织工程研究领域的新热点^[7-8] 。有研究表明，脂肪源间充质干细胞在体外经适当诱导后，Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达增加，将脂肪源间充质干细胞植入肌腱损伤处，肌腱愈合和成熟加快。脂肪源间充质干细胞的确有望成为肌腱组织工程新的种子细胞^[9] ，但是，由于对活体内脂肪源间充质干细胞的归巢、迁移、增殖和分化的过程缺少直接有效的监测手段，到目前为止仍无法阐明活体内脂肪源间充质干细胞促进肌腱再生的机制，一定程度上影响了临床应用的开展^[8] 。
实验将经荧光素酶基因修饰的脂肪源干细胞移植到大鼠跟腱内，用非侵入性活体生物发光成像技术，对移植的脂肪源干细胞在体内的定位及增殖情况进行监测，研究荧光表达的稳定性和持久性，以及基因修饰对脂肪源干细胞生物学特征的影响，探索用活体生物发光成像技术示踪标记肌腱内移植脂肪源干细胞的可行性，为进一步开展用脂肪源干细胞治疗肌腱损伤提供参考资料^[10] 。

材料方法

设计：动物实验观察。
时间及地点：实验于2008年10月至2011年4月在美国弗吉尼亚大学附属医院骨科完成。
材料：
实验动物：健康4周龄SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠4只，雄性，体质量90-120 g；健康8周龄SD大鼠8只，雄性，体质量240-270 g，由美国弗吉尼亚大学实验动物中心提供，许可证号：Protocol No. 3293，07/31/2008，Public Health Service Animal Assurance, #A3245-01，11/20/2012，实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。
主要材料：携带虫荧光素酶报告基因的复制缺陷型腺病毒载体(adenovirus containing the firefly luciferase reporter gene，Ad-luc)由Gary Balian 实验室提供。病毒载体由AdEasy System (Qbiogene，USA)构建^[10] 。猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，SIS)购于Depuy，USA。
活体生物发光成像追踪大鼠跟腱内移植干细胞实验的主要药品、试剂：
Main experimental drugs and reagents:

实验方法：
SD大鼠脂肪源干细胞的分离培养：取4周龄SD大鼠乙醚吸入处死，体积分数75%乙醇消毒皮肤，取腹腔脂肪组织，去除血管及其他组织，用含青霉素、链霉素各100 U/mL的PBS反复冲洗3次后剪成1 mm³小块，再用PBS清洗3次。加入2倍于脂肪体积的0.1%胶原酶Ⅰ工作液，37 ℃水浴中振荡消化30 min。加入等体积分数20%胎牛血清DMEM培养液，780×g离心 5 min。沉淀用体积分数20%胎牛血清DMEM培养液洗2次，过200目筛网，以2×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于 25 cm²培养瓶，于37 ℃体积分数5%CO₂孵箱中培养，24 h后换液。倒置显微镜下观察细胞生长及形态特征。待细胞达80%-90%融合时，用0.25%胰酶消化，按 1∶2传代培养。
缺陷型腺病毒载体体外转染对脂肪源干细胞的影响：将第2代的脂肪源干细胞接种于6孔培养板，细胞数量为5×10⁵/孔，常规条件下培养24 h，移除培养液，加入3×10¹⁰ L^-1缺陷型腺病毒载体颗粒设为病毒转染组， 37 ℃孵育5 h，更换DMEM培养液，继续常规培养^[10] ；对照组(未转染组)，不加入病毒，相同条件下培养；用倒置显微镜(Nikon，Japan)每日观察2组脂肪源干细胞的形态及生长状态变化，并分别在转染后的6和12 d时进行细胞计数。
转染脂肪源干细胞的活体生物发光检测：将第2代的脂肪源干细胞接种于6孔培养板，细胞数量为5×10⁵/孔，常规条件下培养24 h，移除培养液，加入上述浓度的缺陷型腺病毒载体进行转染，方法同上，转染48 h后，进行细胞计数，无菌条件下将转染的细胞与基质凝胶混匀，使凝胶中转染的细胞浓度为6×10¹⁰ L^-1。
取8周龄SD大鼠8只，在其双侧跟腱区域脱毛，沿跟腱表面做皮肤纵切口，暴露双侧跟腱，横断并切除部分跟腱，制作1 cm跟腱缺损模型，保留跖肌腱，跟腱缺损用猪小肠黏膜下层卷成管状桥接修复，5-0肌腱缝合线缝合固定^[11] 。右侧(实验侧)猪小肠黏膜下层管腔内注入10 µL上述转染细胞与基质凝胶的混合物。左侧(对照侧)只注入10 µL基质凝胶做对照。跟腱缺损后1，4，7和14 d，采用活体生物发光成像技术成像系统(Xenogen Corp，USA)检测荧光素酶的表达。
按照150 mg/kg比例向大鼠腹腔注射底物荧光素(Xenogen Corp，USA)，将大鼠俯卧位置于37 ℃成像室内的平台上，体积分数2%乙氟醚+1.5 L/min氧气持续吸入麻醉，活体生物发光成像技术成像系统扫描，从注射后即刻起，每5 min采集图像1次，持续70 min，应用活体成像软件(Xenogen Corp，USA)采集数据，检测跟腱修复区域发射出的荧光光子的数量和空间分布情况，经计算机处理后形成彩色图像。
跟腱标本荧光显微镜下观察：建模后第28天，脱颈处死大鼠，取出双侧跟腱标本，植入OCT冰冻包埋剂中，-20 ℃冷冻1 h，冷冻标本在冰冻切片机上制作连续矢状位冰冻切片(Leica CM 3050，USA)，片厚10 µm。用体积分数70%乙醇洗3次除去组织中OCT包埋剂，再用PBS漂洗(含1%牛血清白蛋白)3次，水溶性封片剂Vectashield封固。荧光显微镜535 nm波长下观察荧光表达情况。
主要观察指标：①体外实验观察脂肪源干细胞分离培养以及转染前后的形态和数量变化，观察其增殖分化情况。②体内实验中，先于活体上用IVIS连续观察大鼠跟腱修复区内外的荧光表达，再于荧光显微镜下观察大鼠跟腱切片中的荧光表达，分析经荧光基因修饰的脂肪源干细胞在跟腱内的存活，增殖及迁徙情况。
统计学方法：使用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，数据采用x(_)±s形式表示，组间的比较采用t 检验进行统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前干细胞移植促进组织修复的研究已取得了较大进展，动物模型是研究干细胞在体内生长及其转归的重要工具，但是理想的研究体内干细胞生物学行为的手段并不多。生物发光活体成像技术是近来发展起来的一种可以利用活体生物发光或荧光成像，直接检测活细胞在动物体内生物学行为的新的技术方法，目前已成为广泛应用于医学、生物学及药物开发等研究领域的前沿技术^[10,14-15] 。与传统的动物模型相比较，所得结果直观可靠，无放射性，安全，操作简单，它能够反映细胞或基因表达的空间和时间分布，从而了解活体动物体内的相关生物学过程、特异性基因功能和相互作用；可以对同一个研究个体进行长时间反复跟踪成像，避免靠不同的时间破坏性地获取标本或宰杀动物，降低实验成本、动物组间人为操作差异，跟踪观察不受影响；其用途广泛，可以非侵入性地连续检测活体动物体内移植细胞存活、增殖、迁徙的过程，非常方便的检测活体动物体内细胞的生长及转移过程、特定基因的表达和评价细胞治疗的效果，活体成像技术已经成为近年来动物模型研究最重要的进展之一^[16-19]。
荧光素酶(Luciferase, luc)是一种生物体内催化底物荧光素(luciferin)发生氧化反应而发光的酶，细胞转染荧光素酶报告基因后可长期表达荧光素酶，并只有在活细胞内的O₂和三磷酸腺苷环境中才能主动催化荧光素而发出可见光，可以穿透5-10 mm组织，具有极低的背景和极高的灵敏度，可作为一种快速反应探针用于指示细胞活性和功能的变化^[20-22] 。常用的荧光标记干细胞的方式有3种：质粒载体转染、病毒载体转染和绿色荧光转基因动物^[23-25] 。质粒转染具有操作简便、对细胞的免疫源性和毒性小等优点，但不十分稳定，转染效率低，容易丢失；病毒载体的优势是表达高效稳定，但存在免疫反应和致癌性等安全隐患；从转基因动物分离得到的干细胞标记稳定，无上述缺点，是最为理想的选择。但目前绿色荧光标记转基因技术在大鼠等动物中的应用尚不成熟，而且转基因动物实验周期长，成本高^[26-27] 。因而，采用病毒载体转染仍然是一种较为有效和常用的方法。实验选择的AdEasy腺病毒表达载体系统，可转染多种类型的哺乳动物细胞。腺病毒载体的优点是，能将外源性基因插入停止分裂的细胞；腺病毒携带的基因副本独立于宿主细胞DNA之外，避免永久插入宿主染色体中；重组腺病毒可在体外扩增到很高的滴定度。因为肌腱和腱鞘的细胞为分裂不活跃的细胞，使用外源基因的目的是在肌腱损伤愈合的起始阶段进行暂时性的治疗，重组腺病毒系统应较为适合肌腱损伤的基因治疗^[28-30] 。实验用缺陷型腺病毒载体转染大鼠脂肪源干细胞，细胞的形态、生长方式和增殖未受到明显影响，对细胞没有明显的毒性作用。转染的脂肪源干细胞植入大鼠跟腱后，用活体生物发光成像技术检测到绿色荧光的稳定表达。这些结果都表明重组腺病毒介导的荧光素酶基因转染是标记大鼠脂肪源干细胞的一种高效、可靠、安全的方法，为进一步进行干细胞移植及基因治疗提供了体内外实验基础。
种子细胞是肌腱组织工程的要素之一，细胞的组织来源应充足，能在体外快速增殖，不引起排异反应和疾病传播等。肌腱细胞是肌腱组织工程理所当然的种子细胞，然而其一些固有的缺陷，如来源有限，取材后有供区并发症，获取的细胞数量低，增殖慢，体外扩增时间长等限制了这一细胞的使用^[31-32] 。较多研究表明成人骨髓源间充质干细胞具备分化成肌腱细胞的能力，并肯定了其在肌腱组织工程中的作用，但是，骨髓的获取同样有一定的并发症，获取的细胞数量低(大约每105个贴附的基质细胞仅有1个为间充质干细胞)，体外扩增时间长，不仅花费高，还有污染及细胞丢失的可能^[33-35] 。近年的研究表明，脂肪源干细胞具有可控制的多向分化能力，其在合适条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肌肉细胞等^[36-37] 。大鼠脂肪源干细胞在一定条件下可表达肌腱细胞特异标志性抗原，其在促进肌腱修复中的作用日益受到人们的关注。脂肪源干细胞与其他干细胞相比的优势在于^[38-39] ：①脂肪源干细胞获取容易，可以避免造成患者较大的创伤。②患者自身来源的细胞可进行自体移植，避免异体移植的免疫排斥反应。③脂肪源干细胞能在体外快速增殖，不必进行永生化处理就能获得足够量的种子细胞用于移植。因此这种细胞可以作为一种潜在的自体移植的细胞来源，符合未来肌腱组织工程及细胞治疗的需要^[40-42] 。实验将大鼠腹腔来源的脂肪源干细胞用荧光素酶报告基因标记后植入大鼠跟腱缺损处，造模后用无损伤活体生物发光成像技术和荧光显微镜在修复段跟腱内检测到荧光基因的表达和大量移植的脂肪源干细胞。表明脂肪源干细胞的移植对大鼠跟腱损伤的修复有一定的促进作用，其在肌腱损伤的细胞治疗方面有一定的应用前景，但移植细胞与周围组织融合的机理，细胞在体内的信息传递及分化等仍需进一步研究。

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延伸阅读

已发表文章：心肺血管病杂志. 2010；29（7）：322-328
主要观察指标：构建萤火虫荧光素酶(LUC)慢病毒载体，转染hMSCs后注射到小鼠皮下，生物发光成像系统连续检测体外hMSCs和小鼠注射部位的发光强度。
结论：可利用LUC慢病毒载体转染hMSCs，并对对小鼠活体内移植的hMSCs进行生物发光示踪监测。
已发表文章：广东医学.2008；29（2）：214-216
主要观察指标：用密度梯度离心法分离纯化大鼠MSCs，以携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒栽体Ad-GFP转染MSCs，不同时间段用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率，CCK-8法检测细胞增殖能力。
结论：重组腺病毒载体Ad—GFP能高效标记MSCs，且标记后细胞的增殖能力和表面标志的表达不受影响。
已发表文章：中国现代医学杂志，2011,21(8):929-933.
主要观察指标：从SD大鼠腹腔脂肪组织中分离出脂肪源间充质于细胞，用生长分化因子-5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导，通过光镜及RT-PCR等检测，确定其是否向肌腱细胞分化。
结论：大鼠脂肪来源的干细胞经GDF-5诱导后有向肌腱细胞分化的倾向，脂肪源干细胞有可能替代骨髓间充质干细胞作为组织工程学的种子细胞，用于肌腱损伤的修复。
已发表文章：Tissue Engineering Part A 2010;16(9)2941-51.
主要观察指标：脂肪组织来源的干细胞用不同浓度的（0-1000ng/ml）的GDF-5诱导12天，于不同时间段进行生化检测，分析细胞外基质的合成情况，肌腱特异分子标志的基因表达等。
结论：GDF-5能诱导脂肪源干细胞向肌腱细胞方向分化，脂肪源干细胞有望成为肌腱组织工程的种子细胞。
已发表文章：American Journal of Sports Medicine.2011;39(6):1282-9
主要观察指标：用Ad-Scx(adenoviral-mediated scleraxis)转染大鼠骨髓来源的干细胞，转染的细胞植入大鼠冈上肌肌腱损伤处，术后2和4周行组织学观察及生物力学测定，确定修复段肌腱胶原纤维及纤维软骨的形成情况。
结论：Scx基因修饰的大鼠骨髓源干细胞移植能促进肌腱的修复。
拟发表文章：《中国组织工程研究》
主要观察指标：用携带荧光素酶的腺病毒载体转染大鼠脂肪源干细胞，将转染的细胞移植到大鼠跟腱缺损处，术后1，4，7，14d用活体生物发光成像技术检测移植细胞的荧光表达，28d荧光显微镜下观察跟腱切片中表达荧光的细胞。
结论：活体生物发光成像技术可成功追踪大鼠跟腱内经荧光基因修饰的脂肪源干细胞。脂肪源干细胞有望成为肌腱组织工程的种子细胞。
本文创新性：实验用生物发光活体成像技术直接检测脂肪源干细胞在大鼠跟腱内的生物学行为。与传统的动物模型相比较，可以对同一动物进行长时间反复跟踪观察，不用破坏性地获取标本或宰杀动物，降低实验成本、动物组间人为操作差异；可连续检测活体动物体内细胞特定基因的表达和评价细胞治疗的效果。用脂肪源干细胞作为肌腱组织工程的种子细胞，其细胞来源丰富；取材后残存脂肪组织仍可扩增，与提取骨髓相比，所得细胞数量大，体外增殖时间短，取材对供者（体）的损伤小，患者恢复快。本文用重组腺病毒载体标记脂肪源干细胞，该载体不仅高效，而且标记后细胞的增殖能力及形态不发生改变。